一颗“纳米球”打破基因测序关键技术垄断

　　本报记者 张佳星

　　把“命门”掌握在自己手中

　　一个不超过信用卡大小的硅基芯片上，密密麻麻阵列分布着几千万个“小室”。小室中正释放噼啪的荧光。每一粒“珍珠”的串入，就会激发出相应荧光，荧光颜色提示了“珍珠”的排列，其对应的DNA密码就此解读出来。

　　“珍珠”是DNA的基本单元——核苷酸，上有4种碱基，人们为碱基加上对应的4种颜色，传递出密码信息。为了解读人类基因组中的核苷酸密码，十几个国家集中力量对其进行破译，即“人类基因组计划”，高通量测序技术的出现终结了漫长、浩大的测序工程时代。

　　截至目前，高通量测序有不同的技术路线。美国Illumina公司在市场和技术上均占有垄断地位。我国华大智造在后发劣势的情况下，通过技术引进和创新，采取不同的技术路线，换道迈进更快、更准的测序“金标准”。

　　荧光在百层“转梯”上“炫舞”

　　1个DNA分子激发出的荧光很微弱，易受背景干扰，难以准确检测。就像一个人的声音很难被听清楚，几百、几千人同时呐喊才能更准确地传递信息。

　　为了“听”懂DNA，必须放大信号。方法是复制出几百个同样的序列，同步反应，同步释放荧光，如同千百人一同呐喊。

　　传统的方法是用PCR(聚合酶链式反应)复制出这“千百人”。华大智造测序仪产品经理汪婧婧博士解释，PCR会把DNA双链像筷子一样分开，每根筷子再去复制，1变2、2变4，n轮之后，达到放大2的n次方的目标。

　　理论很完美，现实很骨感。PCR技术本身的不完美，使得复制的DNA会出错，“和声”中一旦出现“滥竽充数者”，将难以检测准确。

　　PCR的不完美在于两个方面。一个是错误累积。PCR的复制是传递复制，就像综艺节目里的“传递模仿”，只要其中一环出错，会学得越来越走样，传递下去的错误序列也会“累积”。

　　另一个方面是，PCR中必用的聚合酶会出错。就像人累了会疏忽大意一样，聚合酶如果不停装配，“疲了”也会不时出错。

　　有什么办法能够摆脱PCR的这些短板？“如果只复制原版，那么错误累积的问题就会解决。”汪婧婧说。

　　华大智造采用了滚环扩增技术。“单链成环是第一步。在连接酶的作用下，会让DNA片段呈环形。”汪婧婧说，其中的连接酶、试剂和反应条件都是多次试验的最优结果。

　　万里挑一，合成新酶促成精妙滚环

　　“滚环复制是指复制出千百条DNA，均以这个环形DNA为模板。”汪婧婧解释，每滚出一圈，下一圈会“踢走”上一圈。如此往复，就像用转笔刀削铅笔的动作，复制好的DNA会螺旋下来，最终得到经过复制“扩大”的DNA链。

　　“基于物理原理，它在测序的小室里会自然地团成球状。”汪婧婧说，“我们称之为纳米球。”但如果“拎”起来，就会像一条百余层的旋转楼梯，每层旋转的DNA序列相同，完成了信号放大。

　　“之所以能够完成这样精妙的合成动作，是因为选择了恰当的酶。”汪婧婧说，研究团队通过酶工程的手段按需制造出了保真性极高的聚合酶。

　　酶的选用十分重要。每次的读长、生化的反应速度……单个小室里会发生什么，与酶的选用息息相关。汪婧婧介绍，团队通过熟悉酶与DNA的相互作用关系，通过设计酶的结构，包括蛋白组成、1、2、3级的折叠结构等来对酶的性能进行操作，并通过工程菌表达出来。

　　不只如此，还要优化数以百万计的反应条件，寻找酶最活跃的环境，使生化反应时间可以缩短到1分钟以内。

　　“我们的设备读长是慢慢提高的。”汪婧婧说，最开始一个小室里一次只能读50个碱基，直到现在能够读到最长的400个碱基，都是在摸索中不断变长的。

　　“这是我们的自有秘方。”汪婧婧说，从最初收购CG公司获取核心专利技术，实现核心工具的自主可控，到真正拥有自己的核心专利，以及与之相匹配的试剂、材料、生化反应体系等一系列的系统技术，华大智造不断推出经受得住市场检验和比较的产品，追赶并进一步实现对竞争对手的超越。

　　2018年10月，英国政府宣布将开展500万人基因组计划。牛津大学流行病学教授陈铮鸣介绍，英国方面对华大测序技术和其他企业提供的技术做了比较，为他们提供同样的序列进行测序，华大测序的测序结果表现优秀。他认为，英国政府欢迎竞争的存在，因为那样才能保证项目能以最低的价格获得最优的服务。

　　创新继续，不让碱基受损

　　在测序仪研发领域，业内认为新一代的纳米孔技术也很有潜力，它抛弃了荧光检测需要信号放大的弱点，转用直接识别物理电信号来判断DNA的“声音”，或许会带来新的迭代。“现在的问题仍旧是其准确率和效率。”陈铮鸣说，因为效率意味着成本，而成本决定能不能推广。

　　在瞄准运用更新一代技术进行战略规划的同时，华大智造仍在继续创新，把现有技术用得更纯熟，满足不同的测序需求。

　　“人们在碱基上加了荧光基团，可能会让碱基受到损伤，所以才不能提高读长。”汪婧婧表示，那么如果不让碱基受损伤，会不会进一步改良高通量测序技术呢？为此，华大智造发明了荧光与碱基结合的新方法——用抗体作为媒介。“抗体是一种蛋白，DNA会和蛋白特异性相连。”汪婧婧说，团队在抗体上连接荧光，再通过抗体与4种碱基的特异性结合，也实现了对4种碱基的识别。这一技术将进一步提高读长及测序的准确性。

　　“测序技术始终有更高的目标，更快、更精准、更便宜。”汪婧婧说，无论哪种技术，钻得越精深，越能达成目标。每种技术路径都可能是对的，关键在于有没有工匠精神，完成对整个体系的精雕细刻。